Enzimas que catalizan la ruptura hidrolítica de uniones C-O, C-N, C-C, anhídridos fosfóricos,... Las subclases de hidrolasas son las siguientes:
1. Las que actúan sobre enlaces éster.
2. Glucosidasas.
3. Las que actúan sobre enlaces éter.
4. Las que actúan sobre enlaces peptídicos.
5. Las que actúan sobre uniones carbono-nitrógeno diferentes de los peptídicos.
6. Las que actúan sobre anhídridos de ácidos.
7. Las que actúan sobre enlaces carbono-carbono.
8. Las que actúan sobre enlaces de haluros.
9. Las que actúan sobre enlaces nitrógeno-fósforo.
10. Las que actúan sobre enlaces sulfuro-nitrógeno.
11. Las que actúan sobre enlaces carbono-fósforo.
12. Las que actúan sobre enlaces sulfuro-sulfuro.
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